文献综述

药物是人类为了繁衍生息而对自然界的改造过程中发现和发展起来的，而对药物的化学研究则和化学、生物、医学的研究和发展密切相关。我国地域辽阔，植物、动物、微生物等天然资源十分丰富，中草药应用历史悠久，因而对天然产物化学研究有着得天独厚的优势。
水飞蓟素（Silymarin）是从原产于南美洲的菊科保肝药用植物水飞蓟(SilybumMarianumL)种子中提取出来的水难溶性黄酮木脂类化合物。水飞蓟素呈淡黄色的粉末状，味微苦，能溶解于甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于水[1]。它是唯一从植物体中提取出来的、治疗肝病的天然药物。其结构为：

水飞蓟素对多种肝脏毒物引起的肝脏损伤有明显的保护作用，其靶器官为肝脏，进入体内后主要与血浆蛋白结合，以结合型水飞蓟素的形式存在于血浆、胆汁及尿液中。对抗肝损伤药物具有稳定细胞膜[2]，改善肝功能的作用，对急慢性肝炎、肝硬变和代谢中毒性肝损伤具有较好的疗效[3]。
近年来研究发现这一天然药物不仅具有保肝利胆作用，而且还有明显的抗脂质过氧化，抗辐射，清除自由基和抗胃溃疡等作用。水飞蓟素来源广泛，其毒性小，无致畸和诱变作用，在降血脂、防治动脉粥样硬化，预防脑缺血，抗血小板聚集等方面显示出可喜的效果[4]。由于水飞蓟素难溶于水及一般有机溶剂，口服吸收差，其生物利用度较低，从而影响了其临床疗效。但是，水飞蓟素具有改善肝功能、增强肝细胞膜等作用，临床上对急性、慢性肝炎、肝硬变和代谢中毒性肝损伤等均有较好疗效[5~6]；目前对水飞蓟素的含量测定方法主要有分光光度法[7]、薄层扫描法[8]、HPLC法。但至今尚未见到双安培电化学分析研究水飞蓟素的相关文献报道。
通过偶合两个各自独立的、相反的不可逆电对，提出了不可逆电对体系的流动注射双安培检测方法。基于死停终点指示原理的双安培法使用两支相同的极化Pt电极，外加一个小电压（10~200 mV），当溶液中同时存在可在两电极上氧化、还原的电极反应物时，回路中就会有电流流动。双安培法应用于流动注射分析，表现出仪器设备、操作条件以及检测器构造都特别简单、选择性高、灵敏度高、信噪比高，甚至可在有其它易氧化或易还原的物质共存下对待测物直接进行检测等特点。流动注射双安培法已被广泛应用于医药、环境、工业等诸多领域，然而，到目前为止，该方法的应用仅限制于I2/I-、Br2/Br-等少数几种同一物质的可逆电对体系，在很大程度上限制了双安培法的广泛应用[9]。基于不可逆电对体系的流动注射双安培分析法，通过偶合两个各自独立的、具有相反电极过程的不可逆电对来构成双安培法检测体系，实现了在很小的，甚至为0 V的外加电压下对待测物的直接检测，获得了较高的选择性和灵敏度。本文基于水飞蓟素的不可逆氧化和氧化铂的不可逆还原构成的双安培检测体系，建立了流动注射双安培法测定水飞蓟素的新方法，获得满意的结果。所拟方法具有简便快捷、重现性好、试样和试剂消耗量少、灵敏度高、选择性好、设备简单等特点。
1975年丹麦Ruzicka和Hanson首次提出流动注射分析(flow-injectionanalysis, 简称FIA)的概念，指出化学分析可以在非平衡的动态条件下进行，具有适应性广泛、分析效率高、简单、快速、自动化程度高、试剂消耗量少、检测精度高、设备简单等特点，在自动监测和工业在线分析方面受到重视。30多年来，流动注射分析得到了迅速发展，已被广泛应用于环境监测、临床医学、中草药有效成份分析、生物化学分析、血液分析、仪器和饮料等领域。
近几年FI A研究工作在基础研究、FIA催化分析和动力学分析、以及电化学新方法等方面有了很大的进展。流动注射与电化学分析方法联用目前已逐步应用于临床，在国外的分析仪器、分析化学领域是一个热门课题。FIA分析方法要使不同的待分析物产生适当的响应值，通常所需发生的化学反应是不同的，所以没有通用的分析方法。在FIA仪器发展的早期，甚至是在微机化的FIA系统出现以后，仪器的调整、维护和使用都仍需要操作者具有较高的专业技能才能保证检测具有较高的准确性，一定程度上制约了FIA推广，这就需要在提高FIA系统的稳定性、耐用性和简易性方面努力。
1990年Ruzicka和Marshall提出了顺序注射分析(SIA)，由于它流路简单、操作简化、容易实现微机控制，迅速作为FIA的一个分支发展起来，目前已成为FIA研究最活跃的领域之一。从国外FIA系统的发展现状可以更清楚地了解FIA技术的发展动向，按照自动化程度的高低，目前国外FIA仪器产品可以分为四代：流动注射(1代)、顺序注射(2代)、微珠注射(3代)和阀上实验室(4代)。
1.1 流动注射分析的应用
1.1.1 原子吸收光谱
流动注射在线分离预富集能够对混合组分中痕量被测组分进行分离富集，从而达到检测要求，是痕量分析中极为有效的方法之一。Sperling和殷学锋等[10]使用FIA在线固相吸附萃取预富集系统对天然水中的Cr（Ⅵ）、Cr（Ⅲ）进行电热原子吸收光谱测定。由于Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的毒性不同，因而对天然水中铬的测定有现实意义。
1.1.2 原子发射光谱
电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)已广泛应用于各种样品中的元素分析，并逐步发展为同时测定多种痕量元素的常用方法。颜晓梅等[11]利用FIA-ICP-AES系统对多元素瞬时信号进行采集，采用在线电解方法进行铝镁合金剖面分析，同时测定多元素在合金中的分布情况，并以该系统用氢化物发生法测定了样品中砷、锑、硒等元素。
1.1.3 质谱
电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)能快速进行多元素分析，检出限低。FIA与ICP-MS联机能为质谱仪提供稳定的进样条件，并减少基体对测定的干扰。Heithmar等[12]使用流动注射半自动系统测定钛、钒、锰等元素，用酸洗涤、中和后负载到亚氨基二乙酸纤维素的微柱上，使被测元素与基体分离后用ICP-MS检测。
1.1.4 分光光度检测法
FIA分光光度法仍然是最活跃的领域，研究工作主要集中在四个方面：① 基于催化作用建立痕量组分测定方法；② 与在线分离富集、转化技术结合；③ 利用反应速率差别消除干扰或实现同时测定；④ 以已有手工分析方法为基础建立FIA方法，加快测定速度、降低试剂消耗或解决实际难题，其中催化分析方面的内容较前两年明显增多。
1.1.5 荧光和化学发光检测
薛金凤等[13]建立了用荧光分光光度计作为流动注射分析的检测器，用自行研制的流通池测定垃圾渗出液中苯胺的新方法，该法具有选择性好、灵敏度高、重现性好、精密度较高的特点，对蒸馏得到的样品直接进样分析，不再需要萃取和浓缩，从而简化了分析过程，缩短了分析时间，另外分析中不再需要有机试剂，减少了毒性，所用试剂量也大大减少，同时使用荧光分光光度计作检测器，进一步提高了方法的灵敏度和选择性。化学发光分析是近年来获得迅速发展的一种高灵敏的微量和痕量技术，章竹君等[14]将流动注射、光纤技术和荧光检测相结合建立了流动注射光纤荧光探针动力学测铁方法。范顺利等[15]根据头孢氨苄在硫酸溶液中降解后，其产物可在酸性条件下与Ce（Ⅳ）产生化学发光反应，建立了流动注射-化学发光法测定头孢氨苄的新方法。
1.1.6 毛细管电泳
1981年Jorgenson等[16]创立了现代毛细管电泳(CE)，CE具有高灵敏度、高分辨率和高分析速度，是近年来分析化学发展最快的研究领域之一，但CE也存在一些缺陷，如在进样之前，样品必须经过滤、离心、萃取等处理。在离线手工操作条件下，这类前处理大多繁琐、耗时，为了解决这一问题，目前，分析化学工作者正在研究将CE和FIA结合起来的CE-FIA联用系统。方肇伦等[17]研制了流动注射在线固相萃取毛细管区带电泳联用系统(FI-SPE-CZE)，并用这一系统测定了血浆中的痕量伪麻黄碱。试样经离线或在线净化后，被注入连续流动的电解质溶液中，当试样区带流经FI-CE接口时，一部分试样被引入毛细管，在高压电场中分离后得到检测。该系统能以10个试样/h的频率连续进样，检出限为12 μg/L，峰高测定的RSD为1.2%(n=10)。
关于水飞蓟素的测定方法，国家标准中收载的益肝灵片和胶囊分别采用加甲醇超声处理，滤过，在288 nm下，以水飞蓟宾计测定水飞蓟素总黄酮的含量[18]。罗淑荣等[19]采用CS-930型双波长薄层扫描仪对益肝灵片中活性成分水飞蓟宾和水飞蓟亭进行了分离测定。展开剂为甲苯-醋酸乙酯一冰醋酸(2:1:0.5)；显色剂为0.4%二氯氧锆无水乙醇溶液，λs=300 nm，λr=365 mm。
1.2 黄酮类化合物简介
黄酮类化合物是在植物中分布非常广的一类天然产物，其在植物体内大部分与糖结合成苷类，有一部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数的植物体内都含有黄酮类化合物，其对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病等方面起着重要作用。由于最先发现的黄酮类化合物都有一个酮式羟基结构，有呈黄色或淡黄色，故称黄酮。又因分子中含有的碱性氧原子能与矿酸等结合成盐，故又有黄碱素之称。现在所讲的黄酮类化合物已远远超出这种范围，有的并非黄色，而是白色，橙色及红色等，分子结构也有显著差异，其共同的特征是均含有C6--C3--C6基本碳架，即两个苯环通过三个碳原子相互连接而成。由于黄酮类化合物结构相对比较简单，结构测定和全合成研究的比较早，故黄酮类化合物是天然产物化学中研究比较成熟的一类物质。同时，黄酮类化合物分布广泛，生理活性多种多样，如槲皮素、芦丁、葛根素等具有扩冠活性，牡荆素、汉黄芩素等具有抗肿瘤活性，水飞蓟素、（+）—儿茶素等具有保肝作用等，因此引起了人们的广泛研究。而近十年来，黄酮类化合物的研究倾向于其药用价值的开发，更多的涉及提取分离工艺的应用研究，黄酮类化合物的含量测定及制剂等。天然黄酮类化合物更多的是以苷类的形式存在，而且由于糖的种类，数量，连接位置及连接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。
1.2.1 黄酮类化合物的理化性质
黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定性粉末。黄酮，黄酮醇及其苷类多为灰黄至黄色；查尔酮为黄至橙黄色；双氢黄酮，双氢黄酮醇无交叉共轭体系，一般不显色。但在紫外灯下有特征的颜色或荧光，氨水熏后颜色会发生变化；异黄酮类因共轭较短，显微黄色；花色素所显颜色与酸度有关，一般显红(pH<7)、紫(pH=8.5)、蓝(pH>8.5)等颜色。
对于黄酮苷元，分子内含有不对称碳原子的双氢黄酮、双氢黄酮醇、黄烷醇、双氢异黄酮及其衍生物，具有旋光性，其余苷元测定无旋光性。黄酮苷类因结构中含有糖的分子，故均有旋光性，且多为左旋。
黄酮苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇，氯仿等有机溶剂中；黄酮苷类则易溶于水、甲醇等强极性溶剂，难溶或不溶于苯，氯仿等有机溶剂[20]。由于黄酮类化合物多数均含有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液（如碳酸钠水溶液），碱性有机溶剂（如吡啶、甲酰胺、二甲基甲酰胺）；黄酮类化合物的吡喃酮环上的1-位氧原子，因有共用电子对，故表现微弱的碱性，可与强酸如浓硫酸、盐酸等成盐，但极不稳定，加水后即分解。
黄酮类化合物可与镁粉（或锌粉）、盐酸、四氢硼钠（钾）、三氯化铝、氢氧化钠等试剂产生特征的颜色反应，用于黄酮类化合物的鉴别。黄酮类化合物在植物体内的形成，是由葡萄糖分别经莽草酸途径和乙酸—丙二酸途径生成羟基桂皮酸和三分子乙酸，然后合成查尔酮类，再衍变为各类黄酮化合物[21]。此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、解痉、及抗变态等药理活性，说明黄酮类化合物的活性非常之广，而且该类化合物种类繁多，在植物中广泛分布，毒性比较低，因此，黄酮类化合物有很广阔的开发应用前景。
1.2.2 黄酮类化合物的测定
中药有效成分的测定在中药材的品质鉴定，制剂工艺的评价及中药制剂的制控等方面有非常重要的意义。现在主要采用的方法有紫外分光光度法（UV法）[22]、薄层扫描法（TLC-SCAN法）[23~24]、高效液相色谱法（HPLC法）[25]、库仑滴定法[26]等。
目前，水飞蓟素的测定方法主要有分光光度法[18]、薄层扫描法[19]等，但尚未见到采用流动注射双安培法测定益肝灵片中水飞蓟素的相关文献报道，鉴于流动注射双安培法具有在线直接检测、简便快捷、重现性好、试样和试剂消耗量少、灵敏度高、选择性好、设备简单等特点，本文拟采用此方法测定益肝灵片中水飞蓟素的含量。
1.3  研究问题的提出及方案设计
    药物的化学研究和化学、生物、医学的研究和发展密切相关，对药物成份含量的测定已成为一门学科。在药物的化学分析方面，对药物成份含量测定的方法主要有分光光度法、荧光光度法、化学发光分析法、高效液相色谱法、气相色谱法，但这些方法在实践中存在仪器昂贵、操作繁琐、复杂并且效果不好、投入大等问题。鉴于此，本课题拟研究在线直接快速电化学检测新技术、新方法。水飞蓟素是一种含羟基的化合物，分子结构中具有电活性基团，化学性质上很活拨，可在电极上发生氧化还原反应。通过水飞蓟素在一个电极上的不可逆氧化和氧化铂在另一个电极上的不可逆还原，进而建立一种简便、快捷、灵敏度高、选择性好的流动注射双安培直接检测中草药有效成分的新方法新技术。

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