简述基因工程技术的原理、方法和进展，并评价该技术的发展和应用对人类社会的影响
Describes the principle， method and progress of gene engineering technology then evaluate the development and application of the technology's impact on human society
摘要：基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，它为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。文章介绍了基因工程技术的概念、原理、方法等内容，并介绍了基因工程技术在农业、环境保护、医药和科研等方面广泛而深入的应用与最新进展。基因工程技术在造福人类社会的同时也带来了许多安全性问题，我们要以一种正确的态度去认识、对待和使用它。
关键词：基因工程技术，原理，方法，应用与进展，安全性
Abstract： Genetic engineering technology is a burgeoning technology， it provides to the research of gene structure and function of the powerful tools. The article introduces the concept， principle， method， etc of genetic engineering technology and introduces the genetic engineering’s extensive ，in-depth applications and the latest progress in agriculture， environmental protection， medicine and research aspects etc . Gene engineering technology not only bring in the benefit for human society but also result in a lot of security problems， we should take a correct attitude to understand， treat and use it.
Keywords：Genetic engineering technology， principle， method， applications and progress，security
引言
1972年，美国斯坦福大学的P.Berg博士和Jackson等人将猿猴病毒SV40基因组DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。“在细胞外，把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内的无性繁殖获得成功”的工作内容被定义为基因工程[1]。1 基因工程技术概述
1.1基因工程技术的基本概念
“基因工程在理论上可以自成体系，可称为基因工程学，从方法上讲，它又是一门成熟的、应用广泛的实验技术，所以常常又把基因工程研究所涉及到的分子生物学技术统称为基因工程技术[1]”，具体来说，基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
从中我们可以看出，基因工程技术是在分子水平上进行操作的一门技术，它为基因结构和功能的研究提供了有力的手段。
1.2基因工程技术的原理及主要内容
基因工程技术的迅速发展得益于现代遗传学和生物化学成果的积累和应用，其最基本的原理归纳起来应该是——“生物的性状大都可以遗传，因此改变基因就可改变性状”。
而近代分子生物学在理论上的三大发现和技术上的三大发明对基因工程技术的诞生起到了决定性作用[2]，这也是基因工程技术的原理组成。
20世纪40-60年代，分子生物学上的三大理论发现为基因工程技术奠定了理论基础：一是1940年代Avery等人通过肺炎双球菌转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，并且证明了DNA可以将性状在不同生物体之间转移，这一发现被誉为现代生物科学的开端，也是基因工程技术的理论先导；二是1050年代Waston和Crick发现了DNA分子双螺旋结构以及DNA半保留复制原理；三是1960年代遗传信息中心法则的建立。
图1-1 中心法则示意图
三大理论发现虽然从理论上解释了基因工程技术的可能性，但在进行基因工程技术操作时，科学家发现还有三个基本技术问题没有解决：一是如何从生物体内庞大的DNA双链中获得我们需要的基因片段；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将获得的DNA片段连接起来。通过科学家的不懈努力，这三个问题终于在1970年代得到解决，由Smith等人发现的限制性核酸内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒从技术上解决了上面三个问题，这是使基因工程技术从理论走向实践的三大关键性的技术发明。
理论基础与技术基础打好后，接下来就是基因工程技术的主要内容了，概括起来，基因工程技术应包括如下几个主要的内容或步骤[3]：
（1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段（目的基因的获取）；
（2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并且具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子（基因表达载体的构建）；
（3）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖（将目的基因导入受体细胞）；
（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体克隆细胞（目的基因的检测与鉴定）；
（5）从这些筛选出来的受体克隆细胞中提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；
（6）把目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的背景下实现功能表达，产生出人类所需的物质。
图1-2基因工程基本流程示意图
1.3基因工程技术所应用的方法
在整个基因工程中所用到的技术方法很多，可以按照前面提到的步骤对其进行分类：
（1）目的基因的获取：目的基因就是能够产生所需蛋白质的DNA片段，上面要有启动子、终止子和标记基因，启动子、终止子是目的基因DNA上特殊排序的碱基，标记基因用于检测受体细胞是否已经植入目的基因。获取目的基因主要包括以下5种方法：1、用限制性内切酶从基因所在的生物体直接取得；2、人工合成DNA片段（DNA合成仪）；3、PCR反应合成DNA；4、mRNA反转录成cDNA；5、机械切割的方法： 超声波、高速喷射等。
（2）基因表达载体的构建：这个环节涉及到的是基因重组技术，需要使用的工具酶包括限制性核酸内切酶和DNA连接酶，此外还需要可以在受体细胞中可以存在并自我复制的克隆载体，目前使用的载体主要有质粒、噬菌体、柯斯质体、病毒载体以及酵母人工染色体等。
（3）将目的基因导入受体细胞：按受体细胞的不同转化方法可以分为如下几种：1、植物常用的是：农杆菌转化法，基因枪法和花粉管通道法；2、动物就是利用显微注射法，或者灭活的病毒转导；3、细菌可以转化、转导，转化是利用细菌的某些特别菌株；转导是利用噬菌体。
（4）目的基因的检测与鉴定：重组体克隆的筛选与鉴定方法[4]分为以下几种：
1、遗传检测法；2、物理检测法（凝胶电泳检测法、R-环检测法）；3、核酸杂交筛选法；4、免疫化学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、表达载体产物之免疫化学检测法）；5、DNA-蛋白质筛选法；6、转译筛选法。由于只是对这些方法进行简单介绍，所以这里不再对各个方法的具体内容进行展开描述。
图1-3 基因表达载体的构建示意图
2基因工程技术的应用与进展概述
基因工程自从其诞生后就以其强大的生命力渗透进人类生活的方方面面，经过全球各个国家的科学家们近几十年来不懈的努力，现在基因工程技术已经在包括工业、农业、医学、能源、环保、食品、科研在内的众多领域都表现出极大的发展潜力和应用价值，限于篇幅笔者将从医学、环保、科研和农业这四个方面介绍基因工程技术的应用情况与最新进展。
2.1基因工程技术在医学领域的应用与进展
2.1.1基因治疗
从广义说，基因治疗是外源基因通过转基因技术将基因插入患者适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物治疗某种疾病的技术，还包括从分子水平上采取的治疗措施和技术。狭义上说，基因治疗一般用DNA序列，主要的治疗途径是间接体内法，即在体外把基因转入患者靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入患者体内，最终发挥疗效的物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段。目前利用基因对ADA缺乏症、乙型血友病、恶性肿瘤、糖尿病、心脑血管病、各型肝炎和艾滋病等疾病进行治疗已取得重大进展。
2.1.2基因诊断
应用基因工程诊断疾病即基因诊断，又称D N A 诊断，是利用D N A 重组技术，直接从DNA 水平来检测人类疾病的新的诊断手段。基因治疗的方式：一类为基因矫正或置换，即对有缺陷基因的异常序列进行对矫正，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能[5]。
图2-1 基因诊断流程示意图
基因诊断也被扩大用于传染性疾病的检测和诊断，只要找出传染病原的特异性DNA，制成试剂与患者体液反应，如呈阳性便表明患者已感染有该病菌。目前已有结核杆菌、淋球菌、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒、肠道病毒、肺炎支原体等几十种疾病可采用此技术进行诊断，并正在推出可检测几百种疾病的基（DNA）芯片，将使检测诊断的规模得到飞跃扩展，这将是人类基因组草图完成后最直接最大的用途。
2.1.3基因制药
目前， 以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一， 发展前景非常广阔。基因工程药物主要指基因工程活性多肽、细胞因子、抗体、疫苗、激素和DNA药物等。它们对预防和治疗人类的肿瘤、遗传病、糖尿病、心血管疾病以及包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。
利用基因工程制造的药物大多具有特异性强、疗效好、生产量大的优点。目前， 由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂已在全国面向肝炎患者推广[6]，这项突破也被视为是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。2007年，《中国实验血液学杂志》上刊登高丽等人研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂( rBTI) 诱导HL260 细胞凋亡的作用，为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据，也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路[7]。余蓉等[8]预测并构建水蛭素12 肽通过柔性肽(Gly) 3 与r2PA 连接形成的融合蛋白的空间结构与功能获得成功，证实该工程融合蛋白具有良好的抗凝纤溶双功能， 具有成为新一代溶栓药的潜力，这项研究对心血管疾病的治疗具有积极作用。
2.1.4基因工程疫苗
虽然我国动物基因疫苗研究起步较晚，但已经取得了突破性进展。我们国家的基因工程疫苗在动植物方面的研究进展也非常迅速，目前利用基因工程技术已经使用和正在研制开发的新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物可食疫苗等，这些疫苗统称为基因工程疫苗[9]。2005 年，有人获得包含口蹄疫病毒VP1 全长基因、VP3 部分基因和编码3C 裂解酶全长基因的片段，并构建了重组质粒在大肠杆菌中获得成功表达，能与猪抗口蹄疫病毒（FMDV）血清发生反应，并为口蹄疫病的诊断及其基因工程疫苗的研究提供了依据[10]。随着基因工程技术的不断发展，这种突破性进展将会更多。
2.2基因工程技术在环保领域的应用与进展
近些年来，国内经济的快速发展大多都是以牺牲环境为代价的，所以改善环境可以说刻不容缓，我国科学家们将基因工程技术应用于环保问题，着力解决了工农业污水处理这一“老大难”问题，开发并研制出一系列具有良好去污能力的产品和技术。
张弛[11]等人的研究实现了金属硫蛋白基因工程菌在实际污水中去除重金属的工程化应用。此外，为解决矿山、冶金、电镀、电解产生的重金属废水[12]处理问题，近些年来，通过基因工程技术科学家们改造了废水中的微生物，从而实现对重金属离子高效的生物富集[13]。2005年，在扬子石化与南京大学、香港大学、国家环保总局南京环境科学研究所联合承担的国家863 计划项目《跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的研究》 中，科研人员运用了基因工程， 成功地破解了PTA( 精对苯二甲酸) 废水的处理难题。
2.3基因工程技术在科研领域的应用与进展
2.3.1基因芯片分析技术
图2-3 基因芯片诊断示意图
基因芯片，也称DNA微阵列，其分析技术是指将大量DNA片段有规则的排列并固定在某种介质上面，从而检测特定基因表达的一项技术[14]。它将过去生物学中的复杂实验变得十分简单，同时检测的数据大大增多，可以说是生物技术上的一次革命。利用基因芯片技术可快速测定DNA序列。
2.3.2基因组文库作图
DNA芯片通过鉴定重叠克隆的顺序来对基因组文库进行作图。将若干个基因组克隆的DNA提取出来，用限制性内切酶切开，通过PCR扩增荧光标记得到的ssDNA产物分别与DNA芯片杂交，荧光信号强度被均衡化，用统计分析的方法推算出两个克隆之间的相关系数。最后，几个信号最强的克隆可以根据相关系数按正确的顺序排列出来[15]。
2.4基因工程技术在农业领域的应用与进展
2.4.1基因工程技术改良作物品质
实践证明， 利用基因工程可以有效地改善植物的品质， 并且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域， 取得了很好的效果。1997年我国第1个获准进行商品化生产的基因工程番茄品种“华番1号”， 在13~30℃下可贮藏45d左右，大大延长了保鲜期，解决了由于果实具有呼吸跃变期而难贮藏的难题[16]。应用基因工程技术还可以使粮食中的蛋白质含量提高。美国威斯康星大学的研究人员从菜豆提取了储藏蛋白基因，并将其转移到向日葵中后，表达了该基因。
2.4.2基因工程技术研制抗性作物
现在应用基因工程技术研制的抗性作物范围包括抗虫性、抗病性、抗逆性和抗除草剂等，取得了非常显著的成就。
虫害影响作物的产量和品质， 全世界粮食产量因虫害所造成的损失占14%左右。在抗虫性方面我国也取得了很多成就，如1991年我国科学家成功地将苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因导入棉花， 获得了转基因植株；1993年将Bt晶体蛋白基因导入我国棉花品种中， 获得了高抗棉铃虫的抗虫棉。
由于环境恶化和人口增长，用于农业生产的土地紧张问题日益突出，培育抗干旱、耐盐碱等抗逆性能良好的农作物，就可充分利用以前不适宜耕作的土地，或提高干旱、盐碱土地的农作物产量。Murata等通过向烟草导入拟南芥叶绿体的甘油-3-磷酸乙酰转移酶基因， 以调节叶绿体膜脂不饱和度， 使获得的转基因烟草的抗寒性增加。
图2-4 一种转基因植物流程示意图
2.4.3基因工程技术应用于生物固氮
生物固氮比化学固氮有着成本低、环境污染小、能源消耗少等优势，近些年来，通过基因工程技术完善生物固氮技术一直是科学家们着力研究的一个方面。固氮基因工程主要是将克氏肺炎杆菌固氮基因(nif)导入到不能固氮的微生或者植物中，以获得固氮微生物或固氮植物。中国科学院遗传与发育研究所把带有固氮基因的质粒PRD1从大肠杆菌K12jc5564转移到无固氮能力的水稻根系菌4502Y中，表现出较强的固氮能力，经测定接种有该菌的水稻发育明显优于对照植株。
3基因工程技术的发展和应用对人类社会的影响
前面笔者介绍了基因工程技术在人类生产生活中的多方面应用，这些都是基因工程技术对人类生活的积极影响，但是不容忽视的是，基因工程技术在作为一项新技术不断发展的同时其暴露出的许多问题也应该得到我们的足够重视。
3.1转基因食品的安全性问题
转基因食品自从其诞生起就一直受到人们对其安全性的质疑，由于目前转入基因的插入位点是随机性的，外源基因可能引起插入突变、引起某一基因失活、或激活沉没基因。这些突变的表型可能很小，也可能很大，甚至致死，如2005年5月22日，英国《独立报》披露了知名生物技术公司“孟山都”的一份报告，指出以转基因食品喂养的老鼠存在器官变异和血液成分改变的现象，震惊世界。一项研究表明，60%的英国人反对目前的转基因食品，因为越来越多的证据使得人们有充分的理由怀疑它、否定它，或者改进它[2]。
图3-1 转基因生物环境释放风险评估实施原则
3.2转基因技术对生态环境的不利影响
采用基因工程的手段改造生物体，有可能过快打乱自然界经过漫长时间进化所形成的秩序，破坏生态平衡。与“超级细菌”的形成原理相同，作物获得了某种抗虫基因后，害虫在短时间内会大量死亡。然而存活下来的少量害虫会产生变异，通过自然选择，少量害虫活了下来，之后人们将不得不再次利用利用基因工程技术对抗这种害虫，如此循环下去必然会导致恶性结果的出现。而且基因工程还可能破坏食物链的完整性，另据报道，转基因玉米花粉影响黑脉金斑蝶幼虫食用马利筋叶片，死亡率比对照组明显增加。如果在田间种植转基因作物对其他非目标生物的影响也是如此，那么有益昆虫的数量无疑会减少。
3.3基因工程技术对伦理道德的影响
3.3.1克隆技术
克隆技术作为基因工程一个很重要的应用，已经在动物体身上取得了实验的成功，倘若基因克隆技术如果应用到人身，将完全打破以往的生育模式。夫妻、父子等基本的伦理关系会变得模糊不清，社会的基本单位—家庭将会消失，现有的社会秩序会打乱，使人类现有的意识形态、宗教信仰、法律制度变得无所适从[15]。虽然现在很多国家都禁止克隆人类，但是依然有科学家冒天下之大不韪去进行相关实验，情况令人堪忧。
图3-3 克隆羊多利克隆过程
3.3.2基因歧视
人类基因组计划完成后，这可以确定和改造人的致病基因。利用个人基因检测信息，是健康保险公司减少风险、获取更高利润的重要途径，因此健康保险是最早出现基因歧视的行业。在美国某些保险公司和健康护理服务公司，纷纷通过各种途径收集个人的基因咨询，把它作为是否拒绝投保、限制险种、提高保费或更改已签订保单的依据。如何保护个人的遗传隐私将成为一个亟待解决的社会问题。
4 结语
由于基因工程是一项能够按照人类的意愿定向改造基因的技术，它赋予了人类更强大的改造自然的本领，但作为技术的创造者和使用者的人类不能忘记自身同样也是被施用者，人类本身也是自然的一部分。历史已经证明，当人类去试图改变自然的同时，同样也会接受自然对人类的改造，而这种改造在很多时候是难以预料的灾难。任何技术都具有两面性，基因工程技术也是如此，比如基因药物， 它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等， 甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有， 克隆技术如果不加限制， 任其自由发展， 最终有可能导致人类的毁灭。所以中正的看待基因工程的发展和应用是十分必要的。我国基因工程技术尚落后于发达国家， 更应当加速发展， 切不可坐失良机，以便更好的掌控这项技术造福人类。但与此同时，我们需要制定一套综合的、人性化的技术管理规范，从而使工程的风险以及其带来的社会问题降到最小，使基因工程技术真正造福人类。
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